Introduction

（1）引物干粉开盖前13000rpm，室温离心1min。

（2）加入管壁上10倍nmole数值的水（μL）的DEPC水，涡旋混匀，瞬时离心。此为引物储备液（100μM），用后于-20℃保存。

      *引物管上一般是3.0~6.0nmole，加入十倍这个数值微升的水（30~60μL）。

（3）取一新1.5mL EP管，加入380μL DEPC水，上下游引物储备液各吸取10μL于新EP管中，涡旋混匀，瞬时离心。此为引物工作液（2.5μM），可直接用于实验，用后于4℃保存。

Introduction

贴壁细胞总蛋白提取：

用TBS缓冲液润洗贴壁细胞2-3次，最后一次尽量吸干残留液。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）于培养板/瓶内裂解3-5min。期间反复晃动培养板/瓶，使试剂与细胞充分接触。用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5mL离心管中。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。4℃13000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。

悬浮细胞总蛋白提取：

低速离心收集细胞，加入适当体积的冷却的PBS缓冲液重悬，2000rpm离心10 min，吸除上清。重复以上操作两次，收集细胞沉淀。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。4℃13000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。

组织总蛋白提取：

组织块用预冷的PBS缓冲液漂洗2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器中。加入10倍于组织体积的组织蛋白提取试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），冰浴彻底匀浆。将匀浆液转移至离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保匀浆液完全裂解。4℃13000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。

胞浆胞核蛋白提取：

收集细胞，将细胞重悬于适当体积的浆蛋白提取试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）中，振荡混匀15 秒，使细胞完全悬浮并分散开。如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长振荡混匀时间。冰浴30 min。高速振荡混匀5 秒，4℃13000g 离心10 min。吸取上清至一预冷的离心管中，即为细胞浆蛋白。吸尽上清（上清尽量去净，避免浆蛋白污染），加入适当体积的核蛋白提取试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），高速振荡混匀15 秒，使沉淀完全悬浮并分散开。冰浴30min，每隔5min剧烈振荡混匀10～20s， 4℃13000g离心10 min。吸取上清至一预冷的离心管中，即为细胞核蛋白。