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          • 引物干粉使用说明

            Introduction

            1)引物干粉开盖前13000rpm,室温离心1min。

            2)加入管壁上10nmole数值的水(μL)的DEPC水,涡旋混匀,瞬时离心。此为引物储备液(100μM),用后于-20℃保存。

                  *引物管上一般是3.0~6.0nmole,加入十倍这个数值微升的水(30~60μL)。

            3)取一新1.5mL EP管,加入380μL DEPC水,上下游引物储备液各吸取10μL于新EP管中,涡旋混匀,瞬时离心。此为引物工作液(2.5μM),可直接用于实验,用后于4℃保存。

          • Westernblot实验蛋白提取

            Introduction

            贴壁细胞总蛋白提取:

            TBS缓冲液润洗贴壁细胞2-3次,最后一次尽量吸干残留液。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)于培养板/瓶内裂解3-5min。期间反复晃动培养板/瓶,使试剂与细胞充分接触。用细胞刮刀将细胞及试剂刮下,收集到1.5mL离心管中。冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保细胞完全裂解。413000g离心5min,收集上清,即为总蛋白溶液。

            悬浮细胞总蛋白提取:

            低速离心收集细胞,加入适当体积的冷却的PBS缓冲液重悬,2000rpm离心10 min,吸除上清。重复以上操作两次,收集细胞沉淀。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂),振荡。冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保细胞完全裂解。413000g离心5min,收集上清,即为总蛋白溶液。

            组织总蛋白提取:

            组织块用预冷的PBS缓冲液漂洗2-3次,去除血污,剪成小块置于匀浆器中。加入10倍于组织体积的组织蛋白提取试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂),冰浴彻底匀浆。将匀浆液转移至离心管中,振荡。冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保匀浆液完全裂解。413000g离心5min,收集上清,即为总蛋白溶液。

            胞浆胞核蛋白提取:

            收集细胞,将细胞重悬于适当体积的浆蛋白提取试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)中,振荡混匀15 秒,使细胞完全悬浮并分散开。如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开,可以适当延长振荡混匀时间。冰浴30 min。高速振荡混匀5 秒,4℃13000g 离心10 min。吸取上清至一预冷的离心管中,即为细胞浆蛋白。吸尽上清(上清尽量去净,避免浆蛋白污染),加入适当体积的核蛋白提取试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂),高速振荡混匀15 秒,使沉淀完全悬浮并分散开。冰浴30min,每隔5min剧烈振荡混匀10~20s, 4℃13000g离心10 min。吸取上清至一预冷的离心管中,即为细胞核蛋白。
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